CARA PEMERIKSAAN COOMB’S TEST

CARA PEMERIKSAAN COOMB’S TEST

SUMBER FOTO :BLOG TENTANG KEDOKTERAN

A.      PENDAHULUAN

Pemeriksaan Coomb’st test adalah pemeriksaan  yang digunakan untuk mendeteksi adanya antibody pada permukaan eritrosit dan anti-ab eritrosit dalam serum.  Anti body ini menyelimuti permukaan sel eritrosit yang meyebabkan umur eritrosit menjadi lebih pendek dan sering menyebabkan reaksi inkompetibel pada transfuse darah.

B.      TUJUAN PEMERIKSAAN

Untuk mendeteksi adanya ab pada permukaan eritrosit dan anti-ab eritrosit pada serum

C.      PRINSIP PEMERIKSAAN

Eritrosit yang telah dicuci dan yang diselubungi oleh globulin manusia akan diaglutinasi oleh Anti Human Globulin yang ditambahkan ke dalam tabung pemeriksaan.

D.     METODE PEMERIKSAAN

1.      Aglutinasi Langsung (direct Coomb’s test)

2.      Aglutinasi Tidak Langsung

E.      REAGENSIA

1.      Sel golongan darah O normal 2-5 %

2.      Coomb’s control cell positif (CCCP)

3.      Bovin albumin 22% (BA)

4.      Coomb’s Serum ( AHG) yaitu anti human globulin  antibody yang dihasilkan oleh binatang yang disuntikkan serum atau protein manusia untuk mendeteksi Ab yang melekat pada permukaan eritrosit dan menyingkirkan Ab lain yang tidak diinginkan.

5.      Saline

F.       PERALATAN

1.      Incubator (waterbath 0 suhu 37 ⁰ c

2.      Centrifuge

3.      Mikroskop

4.      Timer

5.      Rak tabung

6.      Tabung reaksi ukuran 12 x75 mm

7.      Pipet tetes

8.      Botol semprot

9.      Slide test

10.  Beaker glass

11.  Wadah limbah

G.     CARA KERJA

1.      Aglutinasi Langsung (direct Coomb’s test)

a.      Siapkan alat dan bahan

b.      Tambahkan 2 tetes suspense eritrosit 2-5 % ke dalam tabung I dan II

c.       Cuci suspense eritrosit 2-5 % 3-4 kali dengan saline

d.     Tambahkan kedalam sedimen sel ( tabung I 2 tetes AHG dan tabung II, 2 tetes saline sebagai negative control)

e.      Putar 1000 rpm selama 1 menit atau 3500 rpm selam 15 detik

f.        Amati ada tidakny aglutinasi

g.   Apabila negative tambahkan 1 tetes cccp dan diputar kembali selama 1 menit kecepatan 1000 rpm

h.  Apabila positif berarti pekerjaan benar dan apabila negative pemeriksaan harus diulang kembali.

2.      Aglutinasi Tidak Langsung

a.      Masukkan 2 tetes serum atau plasma yang akan dipriksa ke dalam tabung reaksi

b.      Tambahkan 1 tetes suspense eritrosit 2-5 %  kedalam tabung tersebut

c.       Inkubasi pada suhu 37⁰  C selam 15-60 menit

d.    Tambahkan BA 22% kemudian diputar 1 menit pada 1000 rpm dan baca hasil reaksinya. Setelah itu inkubasi selam 15 menit

e.    Cuci suspense eritrosit 2- 5% 3-4 x dengan salin. Salin pencucian terakhir dibuang sebanyak-banyaknya untuk mencegah pengenceran serum coomb’s

f.        Kemudian tambahkan 2 tetes serum coomb’s dan kemudianputar selam 1 menit 1000 rpm

g.      Baca hasil reaksinya

h.    Apabila hasil negative tambahkan 1 tetes CCCP dan diputar kembali 1000 rpm selam 1 menit

i.   Apabila positif berarti pekerjaan benar dan apabila negative pemeriksaan harus diulang kembali

H.     INTERPRETASI HASIL

1.      Tidak ada aglutinasi = tidak ada irregular antibody

2.      Aglutinasi                  = ada kemungkinan incomplete antibody dalam serum pasien atau plasma donor sesuai dengan sel panel yang dipergunaka

I.     Faktor yang mempengaruhi perlekatan Ab pada sdm invitro :

1.    Temperatur

       Ab yang menyeubungi eritrosit dan serum breaksi oftimal pada suhu 37 ⁰  C. suhu  yang terlalu rendah akan mempengaruhi kecepatan asosiasi Ag dan Ab. Sebaliknya suhu yang terlalu tinggi akan merusak eritrosit dan molekul Ab.  

2.    Ionic Strength.

  Eritrosit  dapat disuspensikan kedalam berbagai media misal dalam lar saline fisiologis, lar albumin, LISS dan reag additive seperti polyethylene glycol (PEG)/hexadimethrine bromide (polybrene). Dalam cairan isotonik, Na ion dan Cl ion bergerombol sekeliling sel dan sebagian menetralisir muatan yang berseberangan pada Ag dan molekul Ab. Effek penyelubungan ini yang merintangi assosiasi Ab dengan Ag dan dapat dikurangi dengan cara mengurangi ionic strength dari media reaksi. Konsekuensi menurunkan konsentrasi garam dari media reaksi  meningkatkan Ab yang melekat pada  eritrosit. Penggunaan albumin kec bila digunakan dibawah kondisi ion yang rendah juga dapat melakukan perlekatan molekul Ab.

3.    Proporsi Serum Terhadap Sel

Suspense eritrosit yangterlalu tinggi atau terlalu rendah dapat mempengaruhi drajat Ab yang menyelimuti eritrosit. Dengan meningkatkan ratio serum terhadap sel dapat mendeteksi Ab yang bereaksi lemah yang tidak terdeteksi dibawah suspensi normal eritrosit.

4.    WaktuInkubasi
Tehnik albumin waktu inkubasi 15 – 30 menit suhu 370 C ® waktu yang adekwat untuk mendeteksi Ab yang menyelimuti sdm yang secara klinis berarti. Ab yang bereaksi lemah, reaksi Ag Ab tidak dapat mencapai keseimbangan dalam waktu inkubasi selama 30 menit dan dengan memperpanjang waktu inkubasi dapat membuktikan keberadaannya.

J.     Sumber Kesalahan

HAsil Negatif Falsu pada Pemeriksaan disebabkan oleh

1.    Tidak mencuci sdm dengan bersih dan baik,  karena globulin yang bebas yang tidak berikatan  dengan sel akan menetralisir AHG.

2.    pemeriksaan terganggu atau tertunda.

·     Pelaksanaan proses pencucian harus dilakukan secepat mungkin untuk mengurangi kehilangan Ab yang terlepas dari sel.

·         AHG harus ditambahkan segera setelah proses pencucian selesai karena Ab yang telah mengadakan ikatan akan terlepas kembali.

·     Setelah AHG ditambahkan harus segera diputar dan dibaca, karena reaksi IgG yang menyelimuti sdm akan melemah setelah inkubasi.

3.    Reagen kehilangan reaktivitas yang disebabkan oleh  penyimpanan yang tidak baik, kontaminasi bakteri / serum manusia. Penyimpanan AHG dianjurkan pada 2 – 80 C, jangan dibekukan, bila warna berubah tidak digunakan lagi. AHG mengalami netralisasi bila terkontaminasi dengan serum manusia / anti–D sera. Hal ini tidak terlihat dengan mata (makroskopis) tetapi terlihat bila diperiksa dengan CCC, hasil reaksi yang seharusnya pos menjadi neg.

4.    Tidak ada AHG pada pemeriksaan, atau lupa menambahkan AHG. Hal ini dapat dicegah dengan memakai AHG yang berwarna.

5.    Penggunaan centrifugasi yang tidak baik
Centrifugasi yang lambat keadaan menjadi tidak optimal untuk aglutinasi, sebaliknya centrifugasi yang terlalu kuat memadatkan sel, sehingga sel sukar untuk terurai.

6.    Jumlah eritrosit  yang ada pada pemeriksaan mempengaruhi reaktivitas. Reaksi yang lemah karena terlalu banyak eritrosit, sebaliknya eritrosit yang terlalu sedikit menyulitkan pembacaan aglutinasi dengan baik.

7.    Reaksi prozone sebagai kemungkinan penyebab pemeriksaan antiglobulin tidak reaktif.

HAsil Positif palsu pada pemeriksaan disebabkan oleh

1.    Sdm sudah dicentrifugasi sebelum dilakukan pencucian. Apabila tidak terlihat  aglutinasi yang tampak setelah penambahan AHG dapat disalah interpretasikan pembacaannya sebagai akibat perselubungan IgG / komplemen. eritrosit penderita cold react auto Ab yang kuat beraglutinasi pada contoh darah yang disimpan pada suhu kamar atau dibawah suhu kamar.

2.  Tabulasi gelas yang tidak bersih terkontaminasi dengan debu, detergent / material lain yang menyebabkan sdm menggumpal / aggregasi.

3.   Over centrifugation dapat memadatkan eritrosir  yaitu agregasi disalah artikan dengan aglutinasi.

4. Reagen yang dibuat tidak baik dan dapat mengandung Ab yang mengakibatkan aglutinasi pada sel yang tidak diselubungi. Enzyme treated red blood cells dapat meningkatkan reaktivitas dengan antispecies Ab dan dapat bereaksi langsung dengan reag AHG yang mengandung kontaminasi aktivitas.